Библиотека
Как правильно организовать ПЦР лабораторию
Методические рекомендации
Статьи
Вопросы и ответы

27.03.2018

Діагностика захворювань, що передаються кліщами

З настанням тепла в лісах, парках і скверах активізуються кліщі. Тому, перебуваючи на природі, варто потурбуватися про власну безпеку, аби ...

01.03.2017

тест AmniSure

Купить тест на определение подтекания околоплодных вод у беременных Амнишур Вы можете так же в аптеках г.Киева:
1. Аптеки "Арника" ...

26.08.2016

ФЛОРОЦЕНОЗ

Комплексный тест нового поколения для диагностики ВСЕХ клинически значимых инфекций урогенитального тракта у женщин репродуктивного возраста. ...

тел/факс +38(044) 501-70-64
моб +38(093) 329-64-04
вопросы о продукции
+38(044) 221-87-57

04086, Киев, а/я 31
SiteHeart
<< Статьи << Библиотека << Главная

Использование методов молекулярной эпидемиологии при проведении эпидемиологического надзора над легионеллёзами

  • Автор: Яцышина С.Б., Портенко С.А., Астахова Т.С., Осина Н.А., Рачина С.А., Гаранина С.Б., Жукова Ю.В., Шишова А.В., Кондратьева Т.Ю., Червякова Н.С., Валова Т.В., Иванчик Н.В., Кречикова О.И., Дурасова А.Л., Куличенко А.Н., Романенко В.В., Шипулин Г.А., Тартаковский И.С., Малеев В.В.
  • Организация: Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москв; Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов; Государственная Смоленская медицинская академия, Смоленск; ФГУЗ ЦГиЭ Свердловской области; Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалея РАМН

Введение

Представители рода Legionella широко распространены в природе. Около 20 видов способны вызывать заболевания людей, при этом 70-90 % случаев пневмоний, вызванных легионеллами, (или болезнь Легионеров) спорадического или вспышечного характера развивается вследствие ингаляции или аспирации водного аэрозоля, контаминированного Legionella pneumophila I серогруппы, однако серьёзную опасность могут представлять также L.pneumophila других серогрупп.
Эпидемиологический надзор за легионеллезом затруднен вследствие отсутствия эффективных методов обнаружения возбудителя в клиническом материале и объектах окружающей среды, поэтому данные о распространении этой инфекции в России и странах СНГ практически отсутствуют. Бактериологическое исследование длительно, трудоемко и обладает невысокой чувствительностью. С помощью иммуноферментного анализа возможно выявление антител только к Legionella pneumophila 1 серогруппы. Серологические методы диагностики легионеллеза являются по своей сути ретроспективными.

Цели и задачи

С целью оптимизации эпидемиологического надзора в ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора совместно с Российским научно-исследовательским противочумным институтом «Микроб» разработана тест-система на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, позволяющая обнаруживать ДНК L.pneumophila в образцах из нижних дыхательных путей больных и окружающей среды, а также оценивать количество микроорганизмов в воде. В задачи исследования входила апробация разработанной тест-системы на клиническом материале и объектах окружающей среды.

Материалы и методы

В качестве мишени для обнаружения всех серогрупп L.pneumophila и L. micdadei, второго по частоте вида, имеющего эпидемическую значимость, выбран участок гена mip. В анализе использовался экзогенный и эндогенный образцы внутреннего контроля, которые позволяют контролировать качество анализа при тестировании и проводить учет потерь ДНК, что отражает реальную концентрацию ДНК L.pneumophila в каждом исследуемом образце воды. Структура олигонуклеотидных зондов, конъюгированных с флуоресцентными красителями позволяла проводить детекцию флуоресценции как во время ПЦР на приборе Rotor Gene, так и после окончания реакции на приборе Ala-1 «Биосан», Латвия. При выполнении расчетов учитывалась степень концентрирования воды.
В работе использованы штаммы: бактерии рода Legionella (L. pneumophila Philadelphia 1 ATCC 33152, L. pneumophila Togus ATCC 33154, L. pneumophila Bloomington ATCC 33155, L. dumoffii Tex-KL, L. longbeachae); 78 культур микроорганизмов из родов Bacillus, Citrobacter, Corynebacterium, Enterococcus, Escherichia, Francisella, Klebsiella, Listeria, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Yersinia.
Клинический материал: кровь (50 образцов) и мазки со слизистых носоглотки и ротоглотки (55 образцов), бронхоальвеолярный лаваж (1 образец), моча (30 образцов) от практически здоровых индивидов; мокрота от пациентов (16 - 87 лет), госпитализированных в клиники г. Смоленска с диагнозом внебольничная пневмония (200 образцов); материал от 133 человек, собранный во время вспышки легионеллёза в г. Верхняя Пышма (всего 230 образцов): 109 ротоглоточных смывов, 2 образца мокроты, 2 образца бронхо-альвеолярного лаважа, 51 образец плазмы крови, 63 образца сыворотки крови, 8 образцов мочи; 10 образцов секционного материала (суспензии легких и селезенки) от 4 умерших пациентов. Образцы окружающей среды: 81 проба (водопроводная вода горячая и холодная, вода из колодцев, фонтанов и открытых водоёмов, вода техническая из градирни, смывы с внутренних поверхностей труб и душевых насадок).
Постановка реакции ПЦР осуществлялась по инструкции к тест-системе «АмплиСенс Legionella pneumophila-Fl» с детекцией в режиме реального времени на приборах RotorGene 3000 или 6000 (Corbett Research, Австралия) или на амплификаторах «GeneAmp 2700» (Applied Biosystems, USA) с детекцией после окончания ПЦР на приборе Aal-1 (Биосан).
Секвенирование фрагментов амплификации выполняли на базе ФГУН ЦНИИЭ методом v.1.1 (Applied Biosystems, USA),“cycle sequence” с набором ABI PRISM Big Dye согласно инструкции изготовителя при использовании автоматического анализатора ABI-3100 PRISM (Applied Biosystems, США).

Результаты

Оценка аналитических характеристик тест-системы с использованием культур микроорганизмов проводилась на базе Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб»). Чувствительность анализа при тестировании культур L. pneumophila составила 100 микробных клеток в 1 мл тестируемой бактериальной суспензии. При тестировании искусственно инфицированного биологического материала чувствительность анализа составила 1000 микробных клеток в 1 мл пробы материала. Положительный сигнал был зафиксирован только при анализе проб, содержащих L. pneumophila. При тестировании микроорганизмов других родов (78 штаммов) и видов рода Legionella (L. dumoffii Tex-KL, L. longbeachae), а также клинического материала от здоровых людей (136 образцов) во всех случаях отмечен отрицательный результат, следовательно, специфичность анализа составила 100%.
Для оценки аналитических характеристик количественного анализа проведены эксперименты по определению линейного диапазона измерения, предела детекции, предела количественного измерения с использованием количественно охарактеризованных препаратов рекомбинантных плазмид. Предел детекции составил 1-5 копий ДНК в реакцию (100-500 копий ДНК/мл), предел количественного измерения составил 10 копий ДНК в реакцию (1000 копий ДНК/мл). Воспроизводимость количественного анализа оценивалась в эксперименте на образцах фильтратов воды из г. Верхняя Пышма, при этом расчётное количество ДНК варьировало с коэффициентом вариаций 21%.
Тест-система была апробирована (на базе Государственной Смоленской медицинской академии) на 200 образцах мокроты от пациентов, госпитализированных в клиники г. Смоленска с сентября 2006 года по апрель 2007 года с диагнозом внебольничная пневмония. Одновременно этот же материал был исследован с помощью стандартного бактериологического анализа. Положительный ответ в ПЦР зафиксирован в двух пробах (1,0 %), тогда как выделить культуру L. pneumophila ни в одном случае не удалось. Для верификации результатов ПЦР-анализа было проведено секвенирование полученных фрагментов амплификации. Установлено полное соответствие нуклеотидной последовательности ПЦР-продуктов фрагменту гена mip L. pneumophila, фланкированному использованными в тест-системе праймерами.

Разработанная тест-система была использована при расследовании вспышки внебольничной пневмонии в г. Верхняя Пышма в июле 2007 года. Тестированию подвергся как клинический материал (секционный материал, мокрота, сыворотка крови, моча), так и образцы внешней среды.
При исследовании материала со вспышки ДНК L.pneumophila обнаружена в секционном материале от 4 умерших (в 4-х фрагментах лёгких и одном образце селезёнки), в одном из двух тестированных образцов свободно-отходящей мокроты и в одном из двух образцов БАЛ. При этом положительный образец БАЛ был получен от впоследствии умершего пациента и исследованный секционный материал также содержал ДНК L.pneumophila. Методом ПЦР в одном из 8 образцов мочи была обнаружена ДНК L.pneumophila. Образцы секционного материала от трёх умерших и те же 8 образцов мочи были исследованы в лаборатории легионеллёзов научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН. Из одного образца легочной ткани была выделена культура L.pneumophila I серогруппы, в 7-ми образах мочи был обнаружен фильтрующийся антиген полисахаридной природы специфичный для L.pneumophila I серогруппы (Binax).
С помощью ПЦР было протестировано 109 мазков из ротоглотки, из них в трёх была обнаружена ДНК L.pneumophila. Мазки с задней стенки глотки, в которых была обнаружена ДНК возбудителя, получены на 2-9 день заболевания от двух пациентов с тяжелым течением заболевания и одного пациента с заболеванием средней тяжести. У одного из этих пациентов с тяжелым течением заболевания ДНК L.pneumophila была обнаружена также в сыворотке крови. В остальных 51 образцах плазмы крови и 62 образцах сыворотки крови ДНК L.pneumophila не была обнаружена. Надо отметить, что легионелла, является внутриклеточным патогеном, локализующимся в макрофагах лёгочной ткани, поэтому такой клинический ма-териал, как мазки из верхних дыхательных путей, моча и кровь не является оптимальным для исследования.
Для проведения как бактериологического, так ПЦР исследования необходимо получение БАЛ или индуцированной мокроты, так как мокрота самостоятельно отходит у больных легионеллёзной пневмонией менее чем в 50 % случаев. ДНК возбудителя может быть обнаружена в мазках с задней стенки глотки, моче и плазме крови пациентов, но в незначительном проценте случаев. В связи с этим, исследование данного материала показано только при невозможности получения мокроты, аспирата и БАЛ, при этом отрицательный результат исследования данного материала нельзя считать окончательным. Если же ДНК L.pneumophila обнаружена в мазках с задней стенки глотки, моче и плазме крови пациентов, положительный результат можно считать окончательным, так как тест обладает специфичностью 100% и более чувствителен, чем бактериологическое исследование. Полученные данные показывают, что диагностическую чувствительность ПЦР-анализа можно увеличить, если собирать клинический материал в наиболее ранние сроки после начала болезни (до начала терапии антибиотиками); при этом ДНК преимущественно обнаруживается в крови и моче у пациентов с более тяжёлым течением болезни.
При исследовании объектов окружающей среды, собранных эпидемиологами в различных местах города Верхняя Пышма, ДНК L.pneumophila была обнаружена в 15 из 81 проб. Секвенирование фрагментов амплификации выявило полное соответствие его нуклеотидной последовательности фрагменту гена mip L. pneumophila.
Положительные образцы включали пробы технической воды из градирни (4) и воду разводящей сети с территории завода ОАО "Уралэлектромедь"(2); пробы горячей воды из теплопунктов (6) и разводящей сети (3). Кроме того, ДНК L.pneumophila выявлена в 3 из 22 смывов с душевых насадок, взятых в квартирах людей, проживающих в городе Верхняя Пышма и госпитализированных с диагнозом пневмония неуточненная. В лаборатории легионеллёзов научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН была выделена культура L.pneumophila 1 серогруппы из одного смыва с поверхности дренажного канала теплопункта.
Дальнейшее детальное молекулярно-эпидемиологическое расследование проводилось с использованием генотипирования ДНК L.pneumophila методом мультилокусного секвенирования по методике экспертной Европейской рабочей группы (EWGLI, http://www.ewgli.org). Проведённое исследование показало идентичность по 5 генам ДНК L.pneumophila, обнаруженной в секционном материале и в горячей воде тепло-пункта жилого дома, что подтвердило аспирационный путь передачи инфекции через горячую воду, контаминированную возбудителем. L.pneumophila. Обнаруженные в технической воде из градирни, в смыве из душевой головки в квартире заболевшего и в смыве из дренажного канала теплопункта L.pneumophila принадлежали к другим аллельным вариантам и, следовательно, не были связаны с эпизодом вспышки.

Заключение

Разработана тест-система для обнаружения всех серогрупп L. pneumophila и L. micdadei. Результаты апробации дали высокую оценку аналитическим характеристикам тест-системы, показана хооршая воспроизводимость количественного анализа.
Использование ПЦР-анализа позволило определить частоту внебольничных пневмоний, вызванных L.pneumophila в Смоленске, которая составила 1%.
Представленные в данной работе исследования показали результативность использования разработанной тест-системы для тестирования объектов окружающей среды с целью мониторинга, выяснения источников заражения людей L.pneumophila при проведении эпидемиологического расследования и подтверждения диагноза при исследовании материала из нижних дыхательных путей или секционного материала в случае смертельного исхода.
Применение ПЦР-анализа способствовало быстрому проведению эпидемиологического расследования вспышки в г. Верхняя Пышма. ДНК L.pneumophila не была обнаружена системе снабжения города питьевой водой и в воде главного городского фонтана, что позволило быстро исключить два из предполагаемых путей передачи, в то же время обнаружение ДНК L.pneumophila в системе горячего водоснабжения подтвердило высказанную ранее версию и позволило своевременно провести противоэпидемические мероприятия.
Полученные данные позволяют предполагать, что использование разработанной тест-системы для мониторинга объектов водоснабжения, кондиционирования воздуха и медицинского оборудования позволит повысить эффективность надзора над заболеваниями, вызванными L.pneumophila.