Библиотека
Как правильно организовать ПЦР лабораторию
Методические рекомендации
Статьи
Вопросы и ответы

01.03.2017

тест AmniSure

Купить тест на определение подтекания околоплодных вод у беременных Амнишур Вы можете так же в аптеках г.Киева:
1. Аптеки "Арника" ...

26.08.2016

ФЛОРОЦЕНОЗ

Комплексный тест нового поколения для диагностики ВСЕХ клинически значимых инфекций урогенитального тракта у женщин репродуктивного возраста. ...

17.07.2016

Пиросеквенирование в клинической диагностике

Мы рады пригласить Вас на семинар посвященный методу пиросеквенирования, и его применении в клинической практике. На семинаре будут обсуждаться вопросы ...

тел/факс +38(044) 501-70-64
моб +38(093) 329-64-04
вопросы о продукции
+38(044) 221-87-57

04086, Киев, а/я 31
SiteHeart
<< Статьи << Библиотека << Главная

Методика проведения исследования клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

Страницы | 1 | 2 |

Оглавление

Принцип метода.
Меры предосторожности.
Взятие и хранение образцов.
Обеззараживание.
Проведение анализа.

ЭТАП 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА.

Дополнительные материалы и оборудование, требуемые для выделения (с указанием фирм-производителей / поставщиков)
Необходимые реактивы.
Порядок работы при использовании комплекта «ДНК-сорб-АМ».
Порядок работы при использовании комплекта «ДНК-сорб-А».

ЭТАП 2. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР C ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ.

Дополнительные материалы и оборудование, требуемые для проведения ПЦР-анализа (с указанием фирм-производителей / поставщиков).
А. Проведение ПЦР-амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке» (при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP)
Б. Проведение ПЦР-амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FRT).
Учёт результатов.
А. Учет результатов при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP.
А1. Учет результатов при использовании ПЦР-детектора «Джин».
А2. Учет результатов при использовании ПЦР-детектора «АЛА-1/4».
Б. Учет результатов при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FRT.
Б1. Учет результатов при работе с прибором «Rotor-Gene 3000» или «RotorGene 6000».
Б2. Учет результатов при работе с прибором «iQ iCycler» («Bio-Rad», США)
Возможные ошибки при учете результатов, полученных при использовании прибора «IQ Icycler» (модель 4) и меры по их устранению.

  • Принцип метода.
  • Меры предосторожности.
  • Взятие и хранение образцов.
  • Обеззараживание.
  • Проведение анализа.
  • ЭТАП 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА.
  • Дополнительные материалы и оборудование, требуемые для выделения (с указанием фирм-производителей / поставщиков)
  • Необходимые реактивы.
  • Порядок работы при использовании комплекта «ДНК-сорб-АМ».
  • Порядок работы при использовании комплекта «ДНК-сорб-А».
  • ЭТАП 2. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР C ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ.
  • Дополнительные материалы и оборудование, требуемые для проведения ПЦР-анализа (с указанием фирм-производителей / поставщиков).
  • А. Проведение ПЦР-амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке» (при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP)
  • Б. Проведение ПЦР-амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FRT).
  • Учёт результатов.
  • А. Учет результатов при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP.
  • А1. Учет результатов при использовании ПЦР-детектора «Джин».
  • А2. Учет результатов при использовании ПЦР-детектора «АЛА-1/4».
  • Б. Учет результатов при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FRT.
  • Б1. Учет результатов при работе с прибором «Rotor-Gene 3000» или «RotorGene 6000».
  • Б2. Учет результатов при работе с прибором «iQ iCycler» («Bio-Rad», США)
  • Возможные ошибки при учете результатов, полученных при использовании прибора «IQ Icycler» (модель 4) и меры по их устранению.

ВЫЯВЛЯЕМЫЕ ВОЗБУДИТЕЛИ

Бактериальные инфекции:

• Chlamydia trachomatis

• Neisseria gonorrhoeae

• Mycoplasma genitalium

• Ureaplasma spp.

• U.parvum / U.urealyticum

• Mycoplasma hominis

• Gardnerella vaginalis

• Treponema pallidum

Вирусные инфекции - герпесвирусы:

• CMV

• HSV I, II

• HSV-typing

Грибковые инфекции:

• Candida albicans

Протозойные инфекции:

• Trichomonas vaginalis

ПРИНЦИП МЕТОДА

В предлагаемых наборов реагентовах для выявления ДНК возбудителя используется метод ПЦР-амплификации ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продукта реакции.
В основе гибридизационно-флуоресцентной (ГФ) детекции лежит принцип гибридизации флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени, в результате которой происходит нарастание интенсивности флуоресценции. Присутствие такого зонда в реакционной смеси позволяет регистрировать накопление продуктов амплификации непосредственно в ходе полимеразной цепной реакции (детекция в режиме «реального времени», «Real-time PCR») или по ее окончании (детекция по «конечной точке», «End-point analysis») путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала. В обоих случаях детекция результатов ПЦР осуществляется без извлечения продуктов реакции из пробирок, что позволяет свести к минимуму риск контаминации продуктами ПЦР. Дополнительным преимуществом данной модификации метода ПЦР является возможность автоматизировать учет результатов анализа, снизить субъективизм в интерпретации результатов.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Исследование разделяется на два этапа и проводится в двух помещениях (ЗОНАХ), согласно МУ 1.3.1888-04 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности».
В ЗОНЕ 1 проводится первичный разбор, регистрация поступивших проб в рабочий журнал и выделение ДНК из клинического материала.
В ЗОНЕ 2 проводится подготовка пробирок для постановки ПЦР и проведение ПЦР и гибридизационно-флуоресцентной детекции.

Анализ результатов и введение готовых результатов в журнал проводится аккредитованным врачом-лаборантом.
1. Необходимо строго соблюдать СП 1.2. 731–99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами».
2. Работать только в одноразовых перчатках, использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером. Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 0,2 %-ный раствор ДП-2Т.
3. При работе с включенным трансиллюминатором пользоваться защитным экраном или специальной защитной маской.
4. Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается переносить их из одного помещения в другое.
5. Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо подвергать ультрафиолетовому облучению.

ВЗЯТИЕ И ХРАНЕНИЕ ОБРАЗЦОВ

Перед началом работы следует ознакомиться с методическими рекомендациями «Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики», разработанными ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора (Москва, 2006 г.).

Для проведения анализа используется следующий клинический материал:

1. У женщин: соскобы (мазки) из цервикального канала, заднего свода влагалища, уретры, помещенные в 300 мкл транспортной среды, осадок клеток первой порции утренней мочи.
2. У мужчин – соскобы из уретры, помещенные в 300 мкл транспортной среды, осадок клеток первой порции утренней мочи, секрет предстательной железы – 300-500 мкл.
3. У детей – осадок клеток первой порции утренней мочи, мазок с конъюнктивы, помещенный в 300 мкл транспортной среды.
Взятие клинического материала должно производиться в пробирки с транспортной средой, предоставляемой фирмой-производителем наборов реагентов.
Хранить материал можно не более суток при температуре от 2 до 8 °С и в течение года при температуре не выше минус 68 °С (или ниже). Допускается однократное замораживание-оттаивание материала. Доставка проб осуществляется в специальном контейнере с охлаждающими элементами.

Для проведения исследования на наличие ДНК определенного микроорганизма анализируется следующий клинический материал:

• для выявления ДНК Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasma spp., U.parvum / U.urealyticum, Mycoplasma hominis, Candida albicans и Gardnerella vaginalis - соскобы (мазки) со слизистых оболочек урогенитального тракта, клеточный осадок мочи;
• для выявления ДНК Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae возможно также использовать мазки с конъюктивы, синовиальную жидкость;
• для выявления ДНК HSV I,II, HSV-typing - соскобы и мазки со слизистых оболочек урогенитального тракта, отделяемое везикул (пузырьковых высыпаний);
• для выявления ДНК CMV - соскобы и мазки со слизистых оболочек урогенитального тракта, клеточный осадок мочи, слюна;
• для выявления ДНК Treponema pallidum – отделяемое (серозный экссудат) эрозивно-язвенных элементов, везикул, соскобы и мазки со слизистых оболочек урогенитального тракта.

При использовании секрета предстательной железы для анализа на наличие возбудителей ИППП (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma spp., Mycoplasma hominis) для выделения ДНК рекомендуется использовать набор реагентов «ДНК-сорб-B».

ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЕ

Обеззараживание биоматериала и реагентов следует проводить на каждой стадии отдельно, помещая одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) в специальные контейнеры, содержащие дезинфицирующий 0,2 % раствор ДП-2Т.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

ЭТАП 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА.

Объем подготовленного клинического материала для анализа – 0,1 мл. Проводится в ЗОНЕ 1 - комнате для обработки клинического материала.

Дополнительные материалы и оборудование, требуемые для выделения (с указанием фирм-производителей / поставщиков)

1. Стерильный ламинарный шкаф (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные системы», Россия).
2. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).
3. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, ОМ-1, г.Ульяновск, Россия).
4. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс g (например, «Elmi», Латвия, «Hettish», Германия).
5. Вортекс (например «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
6. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).
7. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл (например, «Axygen», США).
8. Штативы для микропробирок на 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и наконечников (например, «Axygen», США).
9. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 100 мкл, до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).
10. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема  до 200 мкл и до 1000 мкл (например, фирмы «Ленпипет», Россия).
11. Емкость с дезинфицирующим раствором.
12. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С.
13. Отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки.

Методика проведения исследования клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. ЭТАП 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА.

Необходимые реактивы

Порядок работы при использовании комплекта «ДНК-сорб-АМ»

Объем клинического материала для выделения ДНК - 0,1 мл.
1. Лизирующий раствор (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) прогреть, перемешивая при 65 °С до полного растворения кристаллов.
2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок 1,5 мл (включая отрицательный контроль выделения) и, используя наконечник с аэрозольным барьером, внести в каждую пробирку по 10 мкл ВКО-FL.
3. Ресуспендировать сорбент универсальный до гомогенной консистенции, внести в каждую пробирку по 20 мкл сорбента универсального и по 300 мкл лизирующего раствора, используя наконечники с аэрозольным барьером. Промаркировать пробирки.
4. В пробирки согласно маркировке внести по 100 мкл клинического образца, используя для каждой пробы отдельный наконечник с аэрозольным барьером. В пробирку отрицательного контроля выделения внести 100 мкл ОКО.
5. Пробы тщательно перемешать на вортексе и инкубировать 5 мин. при 65 °С в термостате. После окончания инкубации перемешать на вортексе и поставить в штатив на 2-3 минуты. Еще раз перемешать содержимое пробирок на вортексе и оставить в штативе на 5 минут.
6. Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 10 тыс. об/мин в течение 30 сек. Не захватывая сорбент универсальный, удалить супернатант в колбу-ловушку с помощью вакуумного отсасывателя, используя для каждой пробы отдельный наконечник без аэрозольного барьера.
7. Добавить в пробы по 1 мл отмывочного раствора, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального.
8. Повторить п.6.
9. Поместить пробирки в термостат 65 °С на 5-10 мин. для подсушивания сорбента универсального. При этом крышки пробирок должны быть открыты.
10. В пробирки добавить по 100 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат 65 °С на 5 мин.
11. Центрифугировать пробирки при 12 тыс. об/мин в течение 1 мин. на микроцентрифуге. Супернатант содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.
Очищенную ДНК можно хранить в течение недели при температуре от 2 до 8 °С и в течение 1 года при температуре не выше минус 16 °С.

Порядок работы при использовании комплекта «ДНК-сорб-А»

Объем клинического материала для выделения ДНК - 0,1 мл.
1. Лизирующий раствор (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) прогреть при 65 °С до полного растворения кристаллов.
2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок (включая отрицательный контроль выделения). Внести в каждую пробирку по 10 мкл ВКО-FL и по 300 мкл лизирующего раствора. Промаркировать пробирки.
3. В пробирки с лизирующим раствором и ВКО-FL внести по 100 мкл проб, используя наконечники с аэрозольным барьером. В пробирку отрицательного контроля выделения (ОК) внести 100 мкл ОКО.
4. Пробы тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при 65 °С. Процентрифугировать 5 с при 5 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Если проба растворилась не полностью, процентрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при 12 тыс. об/мин и использовать для выделения ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку.ку.
5. Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 20 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 2 минуты, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 минут.
6. Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 с. Удалить супернатант в колбу-ловушку, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
7. Добавить в пробы по 500 мкл отмывочного раствора, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального, процентрифугировать 30 с при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Удалить супернатант, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
8. Повторить отмывку еще раз, следуя пункту 7, удалить супернатант полностью.
9. Поместить пробирки в термостат 65 °С на 5-10 мин для подсушивания сорбента универсального. При этом крышки пробирок должны быть открыты.
10. В пробирки добавить по 100 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.
11. Процентрифугировать пробирки при 12 тыс. об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Супернатант содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.
Очищенную ДНК можно хранить в течение недели при температуре от 2 до 8 °С и в течение 1 года при температуре не выше минус 16 °С.

ЭТАП 2. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР C ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ

  • Общий объем реакции – 25 мкл, объем ДНК-пробы – 10 мкл. Проводится в ЗОНЕ 2 – комнате для подготовки и проведения ПЦР-амплификации.

Дополнительные материалы и оборудование, требуемые для проведения ПЦР-анализа (с указанием фирм-производителей / поставщиков)

  • 1. Для наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP: флуоресцентный ПЦР-детектор «Джин» («ДНК-Технология», Россия) или «АЛА-1/4» («BioSan», Латвия).
  • 2. Для наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP: амплификатор (термоциклер), например, «Терцик» («ДНК-Технология») при работе с ПЦР-детектором «Джин»; «GeneAmp PCR System 2700» («Applied Biosystems»); «Gradient Palm Cycler» («Corbett Research») или «Терцик» («ДНК-Технология») при работе с ПЦР-детектором «АЛА-1/4».
  • 3. Для наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FRT: амплификатор с детекцией в режиме «реального времени» «Rotor-Gene 3000» или «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия) или «iQiCycler» («Bio-Rad», США).
  • 4. ПЦР-бокс (например, БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарные системы», Россия).
  • 5. Вортекс (например, «ТЭТА-2», фирмы «Биоком», Россия).
  • 6. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).
  • 7. Одноразовые наконечники для микропипеток до 200 мкл (например, «Axygen», США).
  • 8. Одноразовые наконечники с аэрозольным барьером до 100 мкл в штативах (например, «Axygen», США).
  • 9. Штативы для наконечников (например, «Axygen», США) и микропробирок на 0,2 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).
  • 10. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С для выделенных ДНК.
  • 11. Отдельный халат и одноразовые перчатки.
  • 12. Емкость для сброса наконечников.

А. Проведение ПЦР-амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке» (при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP)

Методика проведения исследования клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. А. Проведение ПЦР-амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке» (при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP)

Для проведения всех тестов для выявления инфекционных агентов, вызывающих ИППП, при использовании наборов реагентов семейства «АмплиСенс» используется единый (универсальный) режим амплификации и детекции. Поэтому можно одновременно в одном приборе проводить все эти тесты или любое их сочетание.

Подготовка пробирок для проведения ПЦР

1. Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-FEP для амплификации исследуемых и контрольных проб.
2. В пробирки с ПЦР-смесью-1-FEP на поверхность застывшего воска раскапать по 7 мкл ПЦР-смеси-2-Flu, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-FEP. При использовании пробирок с ПЦР-смесью-1-FEP объемом 0,6 мл (амплификатор без подогреваемой крышки) на поверхность добавить каплю минерального масла для ПЦР.
3. Приготовить контрольный образец «Фон». Для этого в пробирку с ПЦР-смесью-1-FEP на поверхность застывшего воска внести 17 мкл ПЦР-смеси-Фон, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-FEP. При использовании пробирок с ПЦР-смесью-1-FEP объемом 0,6 мл на поверхность добавить каплю минерального масла для ПЦР. Рекомендуется приготовить и использовать 2 контрольных образца «Фон».
4. В готовые пробирки внести по 10 мкл ДНК-проб, выделенных из клинических или контрольных проб.
5. Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо ДНК-пробы внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера.
б) положительный контроль (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО ДНК.

Примечание. Не используемые в данный момент пробирки с ПЦР-смесью-1-FEP следует хранить в защищенном от света месте.

Проведение ПЦР

Для проведения всех тестов для выявления инфекционных агентов, вызывающих ИППП при использовании наборов реагентов семейства «АмплиСенс» используется единый (универсальный) режим амплификации и детекции.
1. Запустить на амплификаторе соответствующую ему программу «65-60-45». Когда температура в ячейках достигнет 95 °С (режим паузы) поставить пробирки* в ячейки амплификатора и нажать кнопку продолжения программы.
*Рекомендуется перед постановкой в амплификатор пробирок объемом 0,6 мл осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с).
Программа «65-60-45» для амплификатора «Терцик».
95 °С – 5 мин
35 циклов: 95 °С – 10сек/ 65 °С – 10 сек / 72 °С – 10 сек
9 циклов: 95 °С – 15сек/ 60 °С – 25 сек / 72 °С – 10 сек
1 цикл: 95 °С – 15сек/ 60 °С – 25 сек
хранение – 10 °С

Программа «65-60-45» для других амплификаторов.

Методика проведения исследования клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Программа «65-60-45» для других амплификаторов.

2.По окончании выполнения программы амплификации приступить к детекции. (Детекцию можно проводить и позже в течение суток после окончания амплификации, если пробирки после окончания амплификации хранить в защищенном от света месте при температуре не более 28 °С).

Б. Проведение ПЦР-амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FRT).

Методика проведения исследования клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Б. Проведение ПЦР-амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FRT).

Подготовка пробирок для проведения ПЦР

1. Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-FRT для амплификации исследуемых и контрольных проб.
2. В пробирки с ПЦР-смесью-1-FRT на поверхность застывшего воска раскапать по 7 мкл ПЦР-смеси-2-Flu, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-FRT.
3. В готовые пробирки внести по 10 мкл ДНК-проб, выделенных из клинических или контрольных проб.
4. Поставить контрольные реакции амплификации:
5. а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо ДНК-пробы внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера.
6. б) положительный контроль (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО ДНК.
Примечание. Не используемые в данный момент пробирки с ПЦР-смесью-1-FRT следует хранить в защищенном от света месте.

Проведение ПЦР

Б1. Порядок работы при использовании прибора «Rotor-Gene 3000» или «RotorGene 6000».
1. Программирование прибора Rotor-Gene 3000 («Corbett Research») для выполнения программы «65-60-45 RG» (универсальной программы для всех тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП с помощью наборов «АмплиСенс») и создание шаблона теста. Для программирования и создания шаблона следует выбрать в окне New Run режим программирования Advanced.
В окне Temperature Profile следует задать программу «65-60-45 RG» для амплификатора «Rotor-Gene 3000»:
95º С – 5 мин
10 циклов: 95 ºС – 20 сек/ 65 ºС – 20 сек / 72 ºС – 20 сек
35 циклов: 95 ºС – 20 сек/ 60 ºС – 30 сек / 72 ºС – 15 сек
детекция флуоресценции по каналам FAM и JOE на 2-м шаге
(60 ºС) второго блока циклирования

Методика проведения исследования клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Проведение ПЦР

1.2 Задать автоматическую калибровку для выбора параметра «gain». Для этого в окне Channel Setup выбрать кнопку Calibrate. В открывшемся окне Auto Gain Calibration Setup нажать кнопку Calibrate Acquiring, пометить галочкой бокс в строке Perform Calibration Before 1-st Acquisition. Для канала FAM/Sybr нужно указать в графе Min Reading значение 10, а в графе Max Reading значение 12. Для канала JOE нужно указать в графе Min Reading значение 1, а в графе Max Reading значение 5. В графе Tube position указан номер пробирки, по которой будет автоматически выбран параметр «gain», по умолчанию это 1-я пробирка в роторе. Поэтому в указанной (1-ой) позиции в роторе должна находиться пробирка с реакционной смесью (любой) *. Закрыть окно Auto Gain Calibration Setup.

Методика проведения исследования клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Проведение ПЦР

*Примечание. При одновременном проведении различных тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП для автоматической калибровки по параметру «gain» можно использовать пробирку с любой из соответствующих реакционных смесей, помещенную в 1-ю позицию в роторе. Нельзя использовать в 1-й позиции пустую пробирку или пробирку, которая уже прошла амплификацию при предыдущих запусках (пробирки после амплификации удаляют из ротора и утилизируют).
1.3 Сохранить запрограммированный шаблон выполнения теста. Для этого запустить его выполнение кнопкой Start Run и в появившемся окне запроса о сохранении файла выбрать тип файла Template. Сохранить файл шаблона под любым удобным именем (например, «ИППП») в папку: Programm files / Rotor-Gene 6 / Templates и закрыть окно New Run Wizard. После этого запограммированный шаблон теста появится в списке шаблонов в окне New Run.
2. Запуск выполнения программы теста с использованием готового шаблона.
Для запуска с использованием готового шаблона выбрать в меню New, вверху окна New Run выбрать Quick Start, затем в списке шаблонов в этом окне выбрать нужный, запрограммированный согласно пункту 1 шаблон.
В окне Sample Setup задать последовательность расположения образцов в роторе, указать для каждого образца тип Unknown (таблица образцов открывается кнопкой Edit Grid). При этом в 1-ой позиции в роторе должна быть помещена одна из пробирок с реакционной смесью (любой) *
Установить пробирки в ротор в соответствии с таблицей, прикрепить ротор, закрутить фиксирующий винт, установить фиксирующее кольцо, закрыть крышку прибора.
Запустить выполнение программы прибором с помощью кнопки Start Run в нижней части окна и задать имя файла, в котором будут сохранены результаты.
3. После окончания реакции можно приступить к учету результатов.

Б2. Порядок работы при использовании прибора «iQ iCycler».

1. Задать схему планшета - расположение пробирок в модуле и измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM и HEX в окне Edit Plate Setup модуля Workshop. Сохранить ее. Назначить использование данной схемы планшета, нажав кнопку Run with selected protocol
2. Запустить на амплификаторе iQ iCycler программу «65-60-45 iQ»: выбрать или создать эту программу в модуле View Protocols и запустить ее c заданной схемой планшета, нажав кнопку Run with selected plate setup.
Программа «65-60-45 iQ» для амплификатора «iQ iCycler»:
(универсальная программа для всех тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП
с помощью наборов «АмплиСенс»)

Методика проведения исследования клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Б2. Порядок работы  при использовании прибора «iQ iCycler».

95º С – 3 мин 30 сек
10 циклов: 95 ºС – 20 сек/ 65 ºС – 20 сек / 72 ºС – 25 сек
35 циклов: 95 ºС – 20 сек/ 60 ºС – 30 сек / 72 ºС – 25 сек
детекция флуоресценции на 2-м шаге (60 ºС) второго блока циклирования.

  • ВНИМАНИЕ! Необходимо, чтобы протокол dynamicwf.tmo в списке протоколов (модуль View Protocols) соответствовал стандартному, показанному на рисунке. Если этот протокол был изменен и не соответствует указанному, его необходимо исправить.

Методика проведения исследования клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Б2. Порядок работы  при использовании прибора «iQ iCycler».

3. Перед запуском выполнения программы в окне Run Prep модуля Workshop следует проверить правильность выбранного имени протокола и имени схемы планшета. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Experimental Plate под строкой Select well factor source. Задать объем реакционной смеси – 25 мкл. Для запуска нажать кнопку Begin.
4. После того, как температура реакционного блока достигнет 95ºС, открыть крышку и поместить реакционные пробирки в ячейки амплификатора в соответствии с предварительно запрограммированной схемой планшета. Закрыть крышку прибора и нажать кнопку Continue Running Protocol в окне блока Run-Time Central, ждать окончания реакции.
5. После окончания программы приступить к учету результатов.